Исследование митохондриальной ДНК (мтДНК) – просто о сложном

Что такое митохондриальная ДНК и зачем ее исследовать

Иногда экспертам требуется установить родство по материнской линии, например, в конфигурациях ребенок (мальчик или девочка) – тетя по материнской линии (сестра матери) или, например, двоюродное родство сестер или братьев, имеющих предположительно общую матрилинейную бабушку и еще множество других конфигураций. Именно для такого родства применяют сравнительный анализ по митохондриальной ДНК.

Митохондриальная ДНК (далее — мтДНК) также, как и Y-хромосома, передается потомкам в неизменном виде, только Y-хромосома передается по мужской линии и только мужчинам, а мтДНК по женской линии передается как дочерям, так и сыновьям. Мужчины наследуют мтДНК от матерей, но не передают ее своим потомкам.

Применение:

Необходимо определить наличие родственной связи между предполагаемыми братом и сестрой по материнской линии. Мы будем исследовать мтДНК разнополых сиблингов (брата и сестры), если они произошли от одного матрилинейного предка (от одной матери) мы это увидим.

А если необходимо установить родство между племянницей и предполагаемой тётей (сестрой предполагаемого отца), то исследование мтДНК не имеет смысла, так как дочь сиблинга мужского пола (племянница) унаследовала мтДНК от своей матери.
 
Что касается материнства, то данное исследование всегда делается по аутосомным маркерам, использование исследования мтДНК возможно, но не целесообразно, так как ребенок является прямым потомком матери и соответственно наследует 50%  генетической информации от нее.

Пример из практики:

Исследование мтДНК дает возможность определить вероятность наличия двоюродного или троюродного родства по материнской линии.
В лабораторию обратилась женщина, которая хотела установить родство с троюродным племянником по материнской линии (подробнее родство представлено на схеме), т.к. она осталась единственной ближайшей родственницей умершего.

В связи с тем, что родство по женской линии не прерывалось, с помощью анализа мтДНК удалось установить троюродное родство даже между разнополыми участниками.
Обратите внимание на вывод эксперта в заключении. Вероятность в 98,6208% при родстве 3 колена достаточно высокая.

Где содержится мтДНК, какой биоматериал берут на исследование

Митохондриальная ДНК содержится во всех клетках организма, поэтому для генетической экспертизы подходит любой биологический материал в котором сохранились хотя бы единичные ядерные клетки или остатки их цитоплазматического материала:

• буккальный эпителий,
• различные мягкие ткани, любой фрагмент мышц или органов,
• жидкая кровь, а также кровь высохшая,
• биологические выделения и их высохшие следы,
• зубы, волосы человека,
• а также отдельные кости, костные фрагменты и т.д.

Исследование по волосам — один из самых частых запросов установления родства по нестандартным образцам ДНК. Для исследования мы берем в работу как целый волос с луковицей (с любого участка тела), так и его фрагмент без луковицы (например, волос с одежды или расчески).

Волос с луковицей используется для установления любого доступного вида родства по аутосомальным маркерам.
Волосы без луковицы пригодны для исследования только мтДНК, т.е. установления родства по материнской линии.

При исследовании по фрагменту волоса имеется ряд ограничений:

• волос не должен быть окрашен,
• волос не должен быть подвержен действию «агрессивных» химических веществ (хим.завивка, ламинирование волос, и тд),
• минимальное количество волос от 5 штук. Вы должны быть уверены, что они принадлежат одному человеку (например, расческой пользовался только один человек).
• длина волоса не менее 3 см. Для исследования подойдет срез от корня до середины волоса, отстриженные кончики волос лучше не использовать.

Чем регламентируется исследование мтДНК на территории РФ

Установление биологического родства с учетом исследования митохондриальной ДНК регламентировано методическими указаниями: «Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления биологического родства" (утв. Минздравом РФ 25.01.2001 n 2001/4)».

Кратко о процессе исследования мтДНК

1. Исследование мтДНК

Это многоэтапный и сложный метод, который основан на исследовании амплифицируемых в ходе полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием, гипервариабельных участков  мтДНК. Гипервариабельные участки (2) — это два полиморфных фрагмента, которые мы называем сегментами и обозначаем, как  ГВС1 и ГВС2, английская версия — HVR-1 и HVR-2.

По факту — это фрагменты кольцевой молекулы мтДНК, расположенные в области D-петли между определенными позициями. В результате исследования, экспертами устанавливается митотип — набор вариантов, отличающихся друг от друга наличием точковых нуклеотидных замен, микроделеций и микроинсерций (их может быть у каждого индивидуума в среднем 10-12), который этот индивидуум унаследовал по своей материнской линии.

2. Сравнение митотипов

Проводится на первичном этапе сначала с эталонной референтной последовательностью мтДНК. За такую последовательность принят первый полностью расшифрованный митотип, описанный в 1981 г. С. Андерсоном и соавт. [Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G. et al.//Nature (1981), Vol. 290, P. 457 — 465], который получил наименование «Кембриджская референтная последовательность» или CRS (англ.: Cambridge Reference Sequence).

3. Сравнительный анализ между установленными митотипами исследуемых индивидуумов. При совпадении митотипов, делается вывод о том, что в исследуемых образцах установлен одинаковый комплекс признаков мтДНК и проводится оценка статистической значимости (рассчитывается вероятность). При несовпадении митотипов делается вывод о том, что в исследуемых образцах установлен различный комплекс признаков мтДНК и соответственно, данные индивидуумы, у которых изъяты образцы принадлежат к различным матрилинейным линиям и родство их по материнской линии исключается.

4. Оформление заключения эксперта с соответствующим выводом.

Срок исследования по мтДНК 20 рабочих дней. Длительность связана со сложностью процесса выделения мтДНК и последующего анализа, поэтому генетические экспертизы на двоюродное родство по материнской линии занимают так много времени.